Cell Counting Kit-8（CCK-8試劑盒）
l 產(chǎn)品簡介：
Cell Counting Kit-8簡稱CCK-8 試劑盒，為MTT法的替代方法，是一種基于WST（水溶性四唑鹽，化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽）的廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速高靈敏度檢測(cè)試劑盒。
CCK-8法與其它檢測(cè)方法之間的比較：
| 細(xì)胞計(jì)數(shù)方法 | MTT法 | XTT法 | WST-1法 | CCK-8法 |
| 形成的formazan的水溶性 | 差 | 好 | 好 | 好 |
| 產(chǎn)品性狀 | 粉末 | 2瓶溶液 | 溶液 | 1瓶溶液 |
| 使用方法 | 配成溶液后使用 | 現(xiàn)配現(xiàn)用 | 無需預(yù)制 | 無需預(yù)制 |
| 檢測(cè)靈敏度 | 高 | 很高 | 很高 | 高 |
| 檢測(cè)時(shí)間 | 較長 | 較短 | 較短 | 最短 |
| 檢測(cè)波長 | 560-600nm | 420-480nm | 420-480nm | 430-490nm |
| 細(xì)胞毒性 | 高,細(xì)胞形態(tài)完全消失 | 很低,細(xì)胞形態(tài)不變 | 很低,細(xì)胞形態(tài)不變 | 很低,細(xì)胞形態(tài)不變 |
| 試劑穩(wěn)定性 | 一般 | 較差 | 一般 | 很好 |
| 大批量樣品檢測(cè) | 可以 | 非常適合 | 非常適合 | 非常適合 |
| 便捷程度 | 一般 | 便捷 | 便捷 | 非常便捷 |
CCK-8用途：藥物篩選、細(xì)胞增殖測(cè)定、細(xì)胞毒性測(cè)定、腫瘤藥敏試驗(yàn)
l 操作說明：
一、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（測(cè)定細(xì)胞具體數(shù)量時(shí)）
1、先用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，然后接種細(xì)胞。
2、按比例（例如：1/2比例）依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個(gè)細(xì)胞濃度梯度，一般要做3-5個(gè)細(xì)胞濃度梯度，每組3-6個(gè)復(fù)孔。
3、接種后培養(yǎng)2-4小時(shí)使細(xì)胞貼壁，然后加CCK-8試劑培養(yǎng)一定時(shí)間后測(cè)定OD值，制作出一條以細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo)（X軸），OD值為縱坐標(biāo)（Y軸）的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以測(cè)定出未知樣品的細(xì)胞數(shù)量（試用此標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提是實(shí)驗(yàn)的條件要一致，便于確定細(xì)胞的接種數(shù)量以及加入CCK-8后的培養(yǎng)時(shí)間。）
二、細(xì)胞活性檢測(cè)
1、在96孔板中接種細(xì)胞懸液（100μL/孔）。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)（在37℃,5% CO2的條件下）。
2、向每孔加入10 μL的CCK-8溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響OD值的讀數(shù)）。
3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)。
4、用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度。
5、如果暫時(shí)不測(cè)定OD值，打算以后測(cè)定的話，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在24小時(shí)內(nèi)吸光度不會(huì)發(fā)生變化。
三、細(xì)胞增值-毒性檢測(cè)
1、在96孔板中配置100μL的細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)（在37℃，5% CO2的條件下）。
2、向培養(yǎng)板加入10μL不同濃度的待測(cè)物質(zhì)。
3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間（例如：6、12、24或48小時(shí)）。
4、向每孔加入10μL CCK-8溶液（注意不要再孔中生成氣泡，它們會(huì)影響OD值的讀數(shù)）。
5、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)。
6、用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度。
7、如果暫時(shí)不測(cè)定OD值，打算以后測(cè)定的話，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在24小時(shí)內(nèi)吸光度不會(huì)發(fā)生變化。
注意：如果待測(cè)物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK-8之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉藥物影響。當(dāng)然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。
備注：
①建議先做幾個(gè)孔摸索接種細(xì)胞的數(shù)量和加入CCK-8試劑后的培養(yǎng)時(shí)間。
②有條件的情況下建議采用多通道移液器，可以減少平行孔減的差異。加入CCK-8試劑時(shí)，建議斜貼著培養(yǎng)板壁加，不要插到培養(yǎng)基頁面下加，容易產(chǎn)生氣泡，會(huì)干擾OD值讀數(shù)。
③白細(xì)胞可能需要培養(yǎng)較長時(shí)間。
④當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96孔板時(shí)，貼壁細(xì)胞的最小接種量至少為1,000 個(gè)/孔 (100 μL 培養(yǎng)基)。檢測(cè)白細(xì)胞時(shí)的靈敏度相對(duì)較低，因此推薦接種量不低于2,500 個(gè)/孔 (100 μL 培養(yǎng)基)。如果要使用24孔板或6孔板實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)先計(jì)算每孔相應(yīng)的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入CCK-8溶液。
⑤如果沒有450nm的濾光片，可以使用吸光度在430-490 nm之間的濾光片，但是450nm濾光片的檢測(cè)靈敏度最高。
⑥培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計(jì)算時(shí)，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會(huì)對(duì)檢測(cè)造成影響。
活力計(jì)算：
細(xì)胞活力*（％）=[A(加藥)-A（空白）]/[A（0加藥）-A（空白）] ×100
A（加藥）：具有細(xì)胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的吸光度
A（空白）：具有培養(yǎng)基和CCK-8溶液而沒有細(xì)胞的孔的吸光度
A（0加藥）：具有細(xì)胞、CCK-8溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度
*細(xì)胞活力：細(xì)胞增殖活力或細(xì)胞毒性活力
保存條件：4℃干燥避光保存，有效期一年。
